5'-RACE法

どうもみなさんこんにちは．
オリンピックでバラエティー番組が潰れるのが不服なD1のやきそばんでーす．

前回は転写因子同定のために行う，MS解析へ供するためのサンプル調製のお話でしたが
今回は，転写開始地点を同定するためのお話であります．

転写開始地点の同定法は「5'-RACE法」と言います．
（RACE：Rapid Amplification of cDNA Ends）

その大まかな流れを示すと，
total RNAの抽出
↓
rRNAの除去
↓
逆転写によるcDNAの合成
↓
1本鎖cDNAの環化
↓
環状cDNAをtemplateにしたPCR
↓
PCR産物のダイレクトsequence
であります．

具体的な方法は下記の通りであります．

1, total RNAは某社のkitを用い，常法に従って抽出します．
（フェノクロを用いて抽出した方が，収率が良く，ゲノムのコンタミも少ないです．）

2, total RNAより，これまた某社のkitを用い，常法に従ってrRNAを除去します．
（ビーズを用いてrRNAとmRNAを分離する方法です．某社のプロトコルにはtotal RNAからでも5'-RACEは可能と記載されていますが，rRNAを除去した方が結果はキレイだと思います．）

3, mRNAを鋳型にして，逆転写酵素を用い，一本鎖cDNAを合成します．
（後で環化させますので，RT-primerは事前にPNKによってリン酸化させておきましょう．）

4, T4 RNA Ligaseを用いて1本鎖cDNAを環状化させます．
（T4 RNA Ligase：5'-P末端のオリゴヌクレオチドと3'-OH末端のオリゴヌクレオチドを結合させる．RNAや1本鎖DNA(cDNA)のライゲーションに用いられます．）

5, 環状cDNAをtemplateとして，インバースPCRを行います．
（インバースPCR用のprimer setは2set準備します．）

6, 念のため，他のprimer setを用いてインバースPCRを行います．

7, PCR産物をゲル抽出し，先ほど登場したprimerを用いてsequence反応を行います．

8, sequence結果をもとに，転写開始地点を同定します．

こんな感じで．．

現在はインバースPCR産物の結果，ノンスペが多く出てしまったので，ノンスペを押さえるべく条件検討をしている最中であります！

実験結果も金メダル♪♪(???)

まとめ
●歯医者には定期的に行きましょう．

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